两个小孩

一种用于内耳siRNA 转染的新型蛋白载体

2021-01-05 10:18:29 来源: 中华耳科学杂志字体[ ]

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中华耳科学杂志, 2020年18卷5期

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一种用于内耳siRNA 转染的新型蛋白载体

亓卫东 丁大连 曹轶倓 袁芳


RNA 干扰(RNAi)作为一种转录后阶段的基因沉默工具,可起到高度特异性的基因敲除效果,与传统的基因敲除及反义技术相比具有高效、特异、低毒、周期短、操作简单等优势。RNAi 在内耳的应用取决于能否保证siRNA 高效转染以及载体的低毒性。我们构建了一种小干扰RNA(siRNA)蛋白转导载体细胞穿透肽-双链RNA 结合域重组融合蛋白(TAT-DRBD)。通过活体动物实验已经证实,这种载体可在24小时内成功携带Cy3 标记的siRNA进入耳蜗内毛细胞和外毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹上皮细胞、椭圆囊斑和球囊斑及壶腹嵴的毛细胞和支持细胞,其经圆窗膜径路的转染效率达到100%[1]。在本研究中,我们在内耳器官离体条件下进一步验证TAT-DRBD 载体的转染效率及安全性,并与经典脂质体载体LipoFiterTM的安全性进行了比较。我们建立了卡铂南美栗鼠的内耳损害动物模型,并在活体南美栗鼠应用RNAi 特异性下调Slc31a1 基因的表达,以进一步证明通过对铜转运输入通道的暂时特异性阻断是否可以有效阻止铂制剂进入靶细胞,从而实现对毛细胞的保护。


1 材料和方法


1.1 TAT-DRBD 载体的构建

细胞穿透肽-双链RNA 结合域重组融合蛋白(TAT-DRBD)由上海近岸蛋白质生物有限公司完成构建。标准化构建流程及氨基酸序列见图1,图2。质控标准,蛋白纯度:SDS-PAGE> 95%,经检测内毒素<1EU/mg,宿主DNA 残留<10ng/剂量,宿主蛋白质残留<0.1%。细胞株于液氮中长期保存。可根据需要随时复苏增殖表达。


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1.2 大鼠耳蜗器官型培养,TAT-DRBD 体外转染

效率及与脂质体LipoFiterTM安全性比较新生SD 大鼠(P3~5 天,购自上海斯莱克)8 只(16耳),雌雄不限。动物断头处死,分离取出耳蜗,在Hank’s 液(Sigma H6648)中以游丝镊仔细去除耳蜗外侧骨壁及螺旋韧带,小心将全耳蜗基底膜自蜗轴取下并分离内侧的螺旋神经节神经元。事先将含鼠尾胶(Corning 354236)、10×Basal MediumEagle (10×BME, Sigma B9638)和2% 碳酸钠(Sigma451614),以9:1:1 比例混合。在35mm 培养皿中滴入15μl 上述预先配制好的溶液并在室温下静置20分钟使之凝结成胶。培养皿内滴入1.5ml 培养液,培养液由2g 血清蛋白粉(BSA, Sigma A-4919), 2ml Serum - Free Supplement (Sigma I- 1884),4.8ml 20% glucose (Sigma G - 2020), 2 ml 200 mM glutamine(Sigma G-6392), 191.2ml of 1 × BME (Sigma B -1522)预混而成。将Hank’s 液内的基底膜取出平铺在培养皿内的凝胶上,放入培养箱(Forma Scientific,USA) ,于37℃/ 5% CO2条件下过夜。

次日培养皿更换培养液,取4个培养皿内加入Cy3 标记的siRNA(广州锐博)/TAT-DRBD 预混液使之终浓度达到100nM/400nM 继续培养12 小时。10% 福尔马林磷酸盐缓冲液固定0.5 小时,0.1MPBS轻轻洗涤3 次。以Alexa 488 phalloidin (ThermoFisher A12379; 1: 200 in PBS) 染色30 分钟,Topro-3(ThermoFisher, T3605, 1:1000 in PBS)染细胞核30 分钟,滴甘油盖片。激光共聚焦显微镜下观察(Zeiss 710,excitation / emission:Alex488:495nm / 518nm, Cy3: 570nm / 650nm, To - Pro -3:642nm/661nm)。

12 个培养皿随机分为2 组(6 耳/组),一组加入TAT-DRBD 使之浓度至400nM, 另外一组按照操作手册每皿加入LipoFiterTM3μl。48 小时后10% 福尔马林磷酸盐缓冲液固定0.5 小时,0.1M PBS 轻轻洗涤3 次。以Alexa 488 phalloidin (Thermo Fisher A12379; 1:200 in PBS)染色30 分钟,滴甘油盖片。激光共聚焦显微镜下观察(Zeiss 710,excitation /emission:Alex488: 495nm/518nm)。图像处理使用配套软件ZEN2.3 和Photoshop CS6。

1.3 建立卡铂内耳损害动物模型及CAP 检测

选择健康成年(9-12 月)南美栗鼠(牡丹江枫丹毛丝鼠养殖有限公司,雌雄不限)8 只,体重400g~600g。动物入组前均通过耳廓反射检查和耳镜检查,采用自身对照,所有动物右耳为对照耳,左耳为靶向Slc31a1 基因siRNA 转染耳。动物均在转染24 小时后接受单次腹腔内卡铂(Sigma C2538,50mg/kg)注射,卡铂于临用前溶于5% 葡萄糖。所有动物在转染前及在卡铂腹腔注射12 天后实验终点处死前检测复合听神经动作电位(compound action potential,CAP)。

1.4 南美栗鼠Slc31a1 基因靶向siRNA 序列、转染液配制及转染操作

根据南美栗鼠Slc31a1的mRNA 序列设计构建了2 条靶向siRNA( 广州锐博),靶序列分别为:GCATGACGATGATGCCTAT 和GCTACTTTCTCATGCTAAT。转染液于使用临时配制。将80μl10μM 混合siRNA(各50%)加入320 μl of 5.5–6μM TAT-DRBD 混合,室温下放置30 min。对照组转染液将80μl 10μM NC-control siRNA 加入320μlPBS。动物麻醉后打开听泡,暴露圆窗龛,使用显微注射器将大约20μl(siRNA 2μM / TAT - DRBD5μM)的转染液滴入圆窗龛,静置5 分钟。使用牙托粉封闭骨窗,丝线缝合伤口。动物保持水平位30 分钟。动物均在注射12 天后实验终点处死并全耳蜗铺片计数毛细胞,通过耳蜗图软件绘制平均耳蜗图。

1.5 耳蜗毛细胞的标记和全耳蜗基底膜取材铺片及毛细胞数据采集

麻醉状态下取出听泡,充分暴露鼓室内壁。解剖显微镜下以0.6mm 金钢钻在蜗尖磨一个小孔作为耳蜗灌流的进入孔,以显微钩针轻轻将镫骨推入前庭池使前庭窗开放,标本采用琥珀酸脱氢酶(Succinic dehydrogenase, SDH)对毛细胞进行永久性特殊标记[2]。将颞骨浸入预混好的SDH孵育液并经蜗尖小孔向耳蜗内缓慢灌流2-3 次直至灌流液从圆窗和卵圆窗流出,然后在38℃恒温箱内孵育45min 直至肉眼可透过骨壳见耳蜗各回呈明显蓝色为止。将颞骨浸入10% 福尔马林磷酸盐缓冲液并灌流固定液2-3 次。将颞骨浸入固定液在4oC冰箱内继续固定至少24 小时。解剖显微镜解剖全耳蜗膜迷路,分段取下全耳蜗基底膜,将取下的基底膜铺放在载玻片上的甘油滴中,盖片并用中性树胶封片。

耳蜗样品于高分辨率显微镜(OlympusIX73)下观察,二组样品选取铺片完整、毛细胞机械损伤少且毛细胞染色清楚的基底膜进行内外毛细胞计数。摄片自基底膜顶回开始,调整焦距续贯获得基底膜上所有毛细胞的清晰照片,加入100μm 标尺。应用耳蜗图软件(Cochleogram Plotter)计算出基底膜全长各个不同位点毛细胞损失程度的单个耳蜗图和平均耳蜗图。


2 结果


2.1 TAT-DRBD 在体外的转染效率与脂质体载

体LipoFiterTM在离体条件下的安全性比较通过新生大鼠耳蜗器官型培养体系证实,转染12 小时后TAT-DRBD 能够在离体条件下有效地转染siRNA 进入基底膜内、外毛细胞,转染效率达到100%,且无明显耳毒性(图3)。图4 显示了在离体条件下,新生大鼠耳蜗基底膜中段在加入指质体LipoFiterTM48小时后会导致严重的耳基底膜内、外毛细胞损害且纤毛排列紊乱。


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2.2 RNAi 介导的Slc31a1 基因表达下调对卡铂南美栗鼠内耳损害的保护

南美栗鼠经单次腹腔注射卡铂(50mg/kg)12 天后全耳蜗铺片平均耳蜗图显示,经RNAi 介导的Slc31a1 基因下调对卡铂内耳损害有一定的保护作用(图5)。治疗耳(左耳)组内毛细胞仅在距蜗尖(Apex)45%~85% 距离处有不超过20% 的毛细胞丢失,曲线平缓。而对照组(右耳)全程均有IHC 损害,在距蜗尖65%~75% 处有近40% 的IHC 丢失。所有动物左、右耳在卡铂注射前后Click 短纯音诱发的CAP 阈值没有发生改变。


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3 讨论


RNAi 是小RNA 分子靶向特异性结合mRNA并使其降解以抑制特定基因表达的过程。由于RNAi 技术投入少、周期短、操作简单,几乎成为一种标准化的分子生物学技术,被广泛应用于基因治疗和基因功能研究等领域。RNAi 能够高效、特异地下调靶基因的表达水平,若能用于临床,将是一种十分有前景的疾病治疗方法[3,4]。由于内耳解剖生理的特殊性,RNAi 在内耳能否发挥效应取决于转染载体的高效性和安全性。就非病毒载体而言,脂质体载体因具有高沉默效率而被广泛应用。但有研究发现脂质体经圆窗膜渗透率低而且作用短暂[5],这限制了RNAi 技术在内耳的应用。TAT-DRBD 作为一种新型的基因重组蛋白载体,具有无毒、高效、可降解的特点,我们在活体南美栗鼠证实其可高效转染内耳多个靶细胞且无明显毒性[1]。在本研究中,应用大鼠耳蜗器官培养,同样证明该载体在离体条件下无明显耳毒性作用。在安全性方面较脂质体有明显优势。我们在进一步的实验中发现(资料未列),在BRL 细胞系,TAT-DRBD 介导的RNAi 沉默Slc31a1 基因效率可达70%,但较LipoFiterTM 略低(>90%)。

耳神经毒性是抗肿瘤铂制剂的主要毒副作用之一。抗肿瘤铂制剂发挥其细胞毒性作用的前提是药物必须首先要进入到细胞内部,只有当铂制剂与细胞内的氯离子发生水合作用再与谷胱甘肽相结合,才能实现其对靶细胞的攻击性。目前已经确定铂制剂进出细胞的唯一途径是通过细胞膜上的铜转运通道,实验证实阻断铜通道可以有效阻止铂制剂进入到细胞内,从而获得理想的保护效果[6, 7]。

除了通过提高细胞外铜离子浓度激发机体对铜转运通道输入蛋白的反馈性抑制或应用铜通道抑制剂保护内耳细胞之外[6-9],应用RNAi 技术使铜转运内流蛋白通道暂时性“沉默”,从而阻断铂制剂进入到靶细胞,是保护内耳毛细胞免受抗肿瘤铂制剂损害的一个“拒敌于国门之外”的新策略。

卡铂是一种具有耳毒性和神经毒性的抗肿瘤铂制剂。研究证实,铂(Pt)进出细胞的跨膜转运是通过铜转运通道[6-8, 10],其中铜转运蛋白Ctr1(Copper transporter Ctr1,由Slc31a1 基因编码)是将细胞外的铜和铂转入到细胞内的内流转运蛋白(Influx transporter),而铜转运蛋白ATP 7A 和7B(ATP7A、ATP7B)是将细胞内的铜和铂排出到细胞外的外排转运蛋白(Efflux transporters),此外,阳离子转运蛋白2(Organic cation transporter 2,OCT2)等也与铂制剂耳毒性发生关系密切[10, 11]。我们在此前的研究证实[7],在大鼠耳蜗内外毛细胞、螺旋神经节神经元及血管纹上皮细胞内均富含Ctr1、ATP7A 和ATP7B[7]。

More 也发现Ctr1 在小鼠耳蜗广泛存在,并与顺铂的耳毒性关系密切[11]。Larson 通过活体实验证实,小鼠敲除Ctr1 基因后顺铂几乎完全丧失了对肿瘤细胞的损害作用[12]。这些结果说明只要阻断了Ctr1的活动就可以有效阻止铂制剂进入靶细胞,从而使靶细胞得到最好的保护。基于这个保护机制,我们研制出可使Ctr1 基因暂时性“沉默”的siRNA,这种siRNA 经蛋白转导载体TAT-DRBD 转染进入细胞,以达到阻断Ctr1 内流蛋白通道的保护目的。

南美栗鼠是目前唯一被发现的可被药物(卡铂)选择性破坏耳蜗IHC、前庭I 型毛细胞及与之相连的耳蜗和前庭周边神经元的哺乳类动物[13]。这种独特的损害周边I 型传入神经系统模式使之在某种程度上可被用于模拟听神经病[14, 15],因而特别有利于研究IHC-传入神经通路的生理病理损害过程。在本研究中,我们采用小剂量(50mg/kg)单次卡铂腹腔注射,平均耳蜗图显示在距蜗尖65%~75% 处有近40%的IHC 丢失。我们此前的研究证实,损失40% IHC 的南美栗鼠并不发生CAP 的阈移[2]。我们早先的研究也证明,即使IHC 损失60%以上,听神经单纤维仍可保持正常的阈值和陡峭的特征频率调谐曲线[16, 17]。

由于转运机制相同,铜转运蛋白在上述铂制剂毒副作用发生中扮演着关键角色,这为我们防范铂制剂毒副作用指明了一个可行的研究方向。Ctr1由Slc31a1 基因表达,应用特定的基因治疗工具抑制其表达理论上可阻断铂进入细胞并进而预防耳毒性发生。在本研究中,通过TAT-DRBD 转染靶向Slc31a1 和siRNA 进入南美栗鼠内耳,以干扰卡铂的跨膜转运,从平均全耳蜗图结果看,起到了较明显的保护作用。Ctr1 是铂跨膜转运的主要内流蛋白,但是细胞膜铂的转运机制复杂,还涉及流出通道如ATP7A 及ATP7B 的影响,单一“关闭”某一蛋白可能难以达到“完全”的阻断。但尽管如此,以上结果仍提示应用RNAi 特异性抑制铂跨膜转运蛋白表达以保护卡铂耳毒性具有潜在的研究价值和应用前景。


[责任编辑: 郭勇]